檢測原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，樣本中兔子睪酮和微孔條上預包被的偶聯(lián)抗原競爭兔子睪酮抗體，加入酶標二抗后，形成包被抗原-抗體-酶標二抗復合物。隨后結合的酶催化TMB底物顯色，樣本吸光值與其含有的兔子睪酮成負相關。通過標準曲線可準確定量樣品中兔子睪酮的含量。通過標準曲線計算所得值乘以樣品處理的稀釋倍數(shù)即為實際樣品中兔子睪酮的含量。
間接競爭法模式圖
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按操作順序形成包被抗原-抗體-酶標二抗復合物后，加入TMB 底物，板孔液體由無色變成藍色，再加入終止液液體變?yōu)辄S色后進行吸光度值測定。
檢測實驗的局限性
僅供科研使用。
試劑盒的使用期限不得超過試劑盒標簽上的有效期。不要將試劑與其他批次或來源的試劑混合使用或替換使用。
如果樣品產(chǎn)生的值高于最高標準，則用測定稀釋劑進一步稀釋樣品，并重復測定。稀釋劑、操作人員、移液技術、洗滌技術、培養(yǎng)時間或溫度以及試劑盒使用年限的任何變化都可能導致結合變化。
樣本采集、處理和存儲的變化可能會導致樣本值的差異。
本試劑盒實驗設計消除了不同樣品中可能潛在的干擾因素的影響，但并不能涵蓋所有潛在影響因素。不能排除存在其他干擾的可能性。
操作要點
為了避免交叉污染，在添加每個標準品、樣品和試劑時應更換移液器槍頭。
當使用自動洗板機時，在加入洗滌緩沖液后加入30秒的浸泡期，或者在洗滌步驟之間將板旋轉180度，可以提高測定精度。
顯色劑應保持無色，直到添加到板中。確保顯色劑不受光線照射。
應按照與顯色劑相同的順序將終止液添加到板中。加入終止液后，孔中形成的顏色將從藍色變?yōu)辄S色。藍色的孔表示終止液未與溶液充分混合。
需要的其他材料
1. 酶標儀，包含450nm測定波長，同時包含600-680nm校正波長更佳；
2. 移液器及槍頭；
3. 蒸餾水或去離子水
4.100-1000mL刻度量筒。
5. 洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機。
6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度。
7. 用于稀釋標準品和樣品的試管。
注意事項
1. 此試劑盒提供的終止液為稀硫酸溶液，具有一定腐蝕性，應謹慎操作。
2. 該試劑盒中的某些成分含有防腐劑，可能會引起皮膚過敏反應，應佩帶口罩避免吸入薄霧。
3. 顯色劑B可能會引起皮膚、眼睛和呼吸道刺激，應佩帶口罩避免吸入薄霧。
4. 佩戴防護手套、防護服、眼睛和面部防護用品。處理后徹底洗手。
試劑準備
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配制：
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
一抗工作液配制：
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×一抗工作液稀釋成1×一抗工作液，根據(jù)所需用量配置。
酶標二抗工作液配制：
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×酶標二抗稀釋成1×酶標抗體工作液，根據(jù)所需用量配置。
備注：
如樣本中待測物濃度高于標準品最高值，請根據(jù)實際情況選擇適當?shù)南♂尡稊?shù) (建議：將待測樣本用樣品稀釋液最低稀釋1倍，在正式實驗之前做預實驗，以確定具體稀釋倍數(shù)) ；標準品母液及100×酶標二抗溶液根據(jù)實驗所需酶標板孔數(shù)吸取一定量配制工作液，剩余溶液應放回-20℃儲存，且避免反復凍融。（若實驗在1-2周內(nèi)做完，標準品母液及100×酶標抗體置于2-8℃保存；若實驗為長時間跨度實驗，建議將標準品母液及100×酶標抗體置于-20℃保存，以保證實驗結果的穩(wěn)定性）
實驗步驟
所有標準品、樣品建議復孔檢測
1.樣本孵育：每孔分別加入50μL不同濃度的標準品/預處理過的待測樣品，同時加入抗試劑50µL/孔（加抗試劑時請使用多道移液器），蓋上封板膜在37℃下孵育30分鐘。孵育結束后，重復步驟1中的清洗步驟3次。
2.二抗孵育：每孔加入100μL酶標抗體工作液，輕輕混勻，蓋上封板膜在37℃下避光孵育30分鐘。孵育結束后，重復步驟1中的清洗步驟4次。
3.底物顯色：每孔首先加入50μL顯色液A，隨后加入50μL顯色液B，輕輕混勻，蓋上封板膜在37℃下避光孵育15分鐘。（加顯色液時請使用多道移液器，根據(jù)樣品和對照抗體的顏色，自行控制顯色時間）
4.終止反應：待顯色反應結束后，每孔加入50μL終止液（加終止液時請使用多道移液器），輕輕混勻，5分鐘內(nèi)用預熱完成的酶標儀在450nm處測吸光值。
實驗步驟匯總
1.加標準品/樣品和一抗，37℃反應30分鐘，洗滌3次。
2.加酶標二抗，37℃反應30分鐘，洗滌4次。
3.加顯色液，37℃避光反應15分鐘。
4.加終止液，在5分鐘內(nèi)讀數(shù)。
結果的計算
以濃度的對數(shù)為橫坐標，OD值為縱坐標，繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標準曲線?；蛘呤褂媚軌蛏伤膮?shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計算機軟件來創(chuàng)建標準曲線。
若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數(shù)。
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