氯霉素(CAP)ELISA試劑盒
簡(jiǎn)介
氯霉素(malachitegreen,MG)是一種可高效殺菌、殺寄生蟲且成本低廉的藥物，在世界各國(guó)水產(chǎn)品養(yǎng)殖領(lǐng)域中被廣泛使用。但是MG在環(huán)境和生物體內(nèi)殘留量高、殘留時(shí)間較長(zhǎng)，不僅會(huì)極大的污染生態(tài)環(huán)境，還會(huì)對(duì)人體造成致癌、致畸等不良影響。
本酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒可以經(jīng)濟(jì)、快速地檢測(cè)水產(chǎn)組織樣品中氯霉素的殘留量。
檢測(cè)原理
本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中氯霉素和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)氯霉素抗體，加入酶標(biāo)二抗后，形成包被抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物。隨后結(jié)合的酶催化TMB底物顯色，樣本吸光值與其含有的氯霉素成負(fù)相關(guān)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線可準(zhǔn)確定量樣品中氯霉素的含量。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得值乘以樣品處理的稀釋倍數(shù)即為實(shí)際樣品中氯霉素的含量。
間接競(jìng)爭(zhēng)法模式圖
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按操作順序形成包被抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物后，加入TMB 底物，板孔液體由無(wú)色變成藍(lán)色，再加入終止液液體變?yōu)辄S色后進(jìn)行吸光度值測(cè)定。
檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的局限性
僅供科研使用。
試劑盒的使用期限不得超過(guò)試劑盒標(biāo)簽上的有效期。不要將試劑與其他批次或來(lái)源的試劑混合使用或替換使用。
如果樣品產(chǎn)生的值高于最高標(biāo)準(zhǔn)，則用測(cè)定稀釋劑進(jìn)一步稀釋樣品，并重復(fù)測(cè)定。稀釋劑、操作人員、移液技術(shù)、洗滌技術(shù)、培養(yǎng)時(shí)間或溫度以及試劑盒使用年限的任何變化都可能導(dǎo)致結(jié)合變化。
樣本采集、處理和存儲(chǔ)的變化可能會(huì)導(dǎo)致樣本值的差異。
本試劑盒實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)消除了不同樣品中可能潛在的干擾因素的影響，但并不能涵蓋所有潛在影響因素。不能排除存在其他干擾的可能性。
操作要點(diǎn)
為了避免交叉污染，在添加每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品、樣品和試劑時(shí)應(yīng)更換移液器槍頭。
當(dāng)使用自動(dòng)洗板機(jī)時(shí)，在加入洗滌緩沖液后加入30秒的浸泡期，或者在洗滌步驟之間將板旋轉(zhuǎn)180度，可以提高測(cè)定精度。
顯色劑應(yīng)保持無(wú)色，直到添加到板中。確保顯色劑不受光線照射。
應(yīng)按照與顯色劑相同的順序?qū)⒔K止液添加到板中。加入終止液后，孔中形成的顏色將從藍(lán)色變?yōu)辄S色。藍(lán)色的孔表示終止液未與溶液充分混合。
需要的其他材料
儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹儀、恒溫箱、恒溫水浴鍋、移液槍
試劑：乙酸乙酯、正己烷、蒸餾水、試劑A：0.36M亞硝酸基鐵氰化鉀（*水溶液易分解由紅色變成綠色此時(shí)不能再用）（牛奶，奶粉用）、試劑B：1M硫酸鋅（牛奶，奶粉用）
注意事項(xiàng)
此試劑盒提供的終止液為稀硫酸溶液，具有一定腐蝕性，應(yīng)謹(jǐn)慎操作。
該試劑盒中的某些成分含有防腐劑，可能會(huì)引起皮膚過(guò)敏反應(yīng)，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。
顯色劑B可能會(huì)引起皮膚、眼睛和呼吸道刺激，應(yīng)佩帶口罩避免吸入薄霧。
佩戴防護(hù)手套、防護(hù)服、眼睛和面部防護(hù)用品。處理后徹底洗手。
樣品預(yù)處理
下面列出的樣品收集和儲(chǔ)存條件旨在作為一般性指導(dǎo)。樣品穩(wěn)定性尚未評(píng)估。
1.魚蝦和肉樣樣本
（1）稱取均質(zhì)后的組織樣本3±0.05g于15mL離心管中；
（2）加入3mL的蒸餾水，振蕩混勻；
（3）加入6mL乙酸乙酯，振蕩混合10min，4000r/min離心10min；（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象或乙酸乙酯層不足3mL，需混勻后提高轉(zhuǎn)速和延長(zhǎng)離心時(shí)間重復(fù)離心）。
（4）移取上層溶液4mL于15ml離心管中，置于60℃氮吹儀中進(jìn)行吹干。
（5） 吹干后加入1mL正己烷，渦旋震蕩1min，再加入1mL PBST緩沖液，充分混勻后于4000r/min離心5min；去除上層正己烷相（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，則重復(fù)離心）
（6）取50µL下層用于分析。
樣品稀釋倍數(shù)：0.5倍
2.蜂蜜樣本
（1）稱取均質(zhì)后的組織樣本2±0.05g于15mL離心管中；
（2）加入4mL的蒸餾水，充分振蕩混勻；
（3）加入4mL乙酸乙酯，振蕩混合10min，4000r/min離心10min；（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象或乙酸乙酯層不足3mL，需混勻后提高轉(zhuǎn)速和延長(zhǎng)離心時(shí)間重復(fù)離心）。
（4）移取上層溶液2mL于15ml離心管中，置于60℃氮吹儀中進(jìn)行吹干。
（5）吹干后加入1mL正己烷，渦旋震蕩1min，再加入1mL PBST緩沖液，充分混勻后于4000r/min離心5min；去除上層正己烷相（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象，則重復(fù)離心）
（6）取50µL下層用于分析。
樣品稀釋倍數(shù)：1倍
3.牛奶樣品
（1）取10mL牛奶樣品，加入50mL離心管；
（2）加入10mL正己烷，充分振蕩5min，4000r/min，離心10min；
（3）從底部取5mL無(wú)脂牛奶于15mL離心管中；
（4）加入500µL試劑A，振蕩1min；加入500µL試劑B，劇烈震蕩5min；4℃ 4000r/min離心10min；
（5）取1.8mL上清至15mL離心管中，加入6mL乙酸乙酯，劇烈震蕩5min；4000r/min離心10min；（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象或乙酸乙酯層不足3mL，需混勻后提高轉(zhuǎn)速和延長(zhǎng)離心時(shí)間重復(fù)離心）
（6）取上層乙酸乙酯4mL到離心管中，置于60℃氮吹儀中進(jìn)行吹干；
（7）吹干后加入1mL正己烷，再加入200µL PBST緩沖液，充分混勻后于4000r/min離心5min；
（8）去除上層正己烷相，取下層水相50µL用于檢測(cè)。
樣本稀釋倍數(shù)：1倍
4.蛋
（1）取1g已勻漿全蛋（含蛋白和蛋黃）于15mL離心管中；
（2）加入6mL乙酸乙酯，振蕩混合10min，4000r/min離心10min；（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象或乙酸乙酯層不足3mL，需混勻后提高轉(zhuǎn)速和延長(zhǎng)離心時(shí)間重復(fù)離心）
（3）取上層乙酸乙酯3mL到15mL離心管中，置于60℃氮吹儀中進(jìn)行吹干；
（4）吹干后加入1mL正己烷，再加入200µL PBST緩沖液，充分混勻后于4000r/min離心5min；
（5）去除上層正己烷相，取下層水相50µL用于檢測(cè)。
樣本稀釋倍數(shù)：1倍
5.飼料
（1）取1g飼料于15mL離心管中；
（2）加入4mL乙酸乙酯，振蕩混合10min，4000r/min離心10min；（如出現(xiàn)乳化現(xiàn)象或乙酸乙酯層不足3mL，需混勻后提高轉(zhuǎn)速和延長(zhǎng)離心時(shí)間重復(fù)離心）
（3）取上層乙酸乙酯1mL到15mL離心管中，置于60℃氮吹儀中進(jìn)行吹干；
（4）吹干后加入1mL正己烷，再加入200µL PBST緩沖液，充分混勻后于4000r/min離心5min；
（5）去除上層正己烷相，取下層水相50µL用于檢測(cè)。
樣本稀釋倍數(shù)：4倍
試劑準(zhǔn)備
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配制：
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標(biāo)準(zhǔn)品配制：
試劑盒中取出標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)備7個(gè)試管，先將1000ppb標(biāo)準(zhǔn)品（200µL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至50ppb（例：50µL的標(biāo)準(zhǔn)品母液+950µL的1×稀釋液，制備得到1000μL的50ppb濃度標(biāo)準(zhǔn)品），隨后在7個(gè)試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這7個(gè)單獨(dú)的試管中將50ppb標(biāo)準(zhǔn)品依次2倍倍比稀釋至7個(gè)梯度，共配制7個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，依次為：50ppb、25ppb、12.5ppb、6.25ppb、3.13ppb、1.56ppb，從最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中吸取500μL標(biāo)準(zhǔn)品到下一個(gè)試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標(biāo)準(zhǔn)品(0ppb)。
一抗工作液配制：使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×一抗工作液稀釋成1×一抗工作液，根據(jù)所需用量配置。
酶標(biāo)二抗工作液配制：
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×酶標(biāo)二抗稀釋成1×酶標(biāo)抗體工作液，根據(jù)所需用量配置。
備注：
如樣本中待測(cè)物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況選擇適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù) (建議：將待測(cè)樣本用樣品稀釋液最低稀釋1倍，在正式實(shí)驗(yàn)之前做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定具體稀釋倍數(shù)) ；標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)二抗溶液根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需酶標(biāo)板孔數(shù)吸取一定量配制工作液，剩余溶液應(yīng)放回-20℃儲(chǔ)存，且避免反復(fù)凍融。
實(shí)驗(yàn)步驟
所有標(biāo)準(zhǔn)品、樣品建議復(fù)孔檢測(cè)
1.樣本孵育：每孔分別加入50μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品/預(yù)處理過(guò)的待測(cè)樣品，同時(shí)加入一抗試劑50µL/孔（加一抗試劑時(shí)請(qǐng)使用多道移液器），蓋上封板膜在37℃下孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，每孔加入300μL 1×洗滌緩沖液，輕輕晃動(dòng)30秒，甩干并在紙上拍干，以這種方式清洗3次。
2.二抗孵育：每孔加入100μL酶標(biāo)抗體工作液，輕輕混勻，蓋上封板膜在37℃下避光孵育30分鐘。孵育結(jié)束后，重復(fù)步驟1中的清洗方式清洗4次。
3.底物顯色：每孔首先加入50μL顯色液A，隨后加入50μL顯色液B，輕輕混勻，蓋上封板膜在37℃下避光孵育15分鐘。（加顯色液時(shí)請(qǐng)使用多道移液器，根據(jù)樣品和對(duì)照抗體的顏色，自行控制顯色時(shí)間）
4.終止反應(yīng)：待顯色反應(yīng)結(jié)束后，每孔加入50μL終止液（加終止液時(shí)請(qǐng)使用多道移液器），輕輕混勻，5分鐘內(nèi)用預(yù)熱完成的酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值。
精密度
批內(nèi)精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在同一個(gè)板塊內(nèi)精度評(píng)估。
批內(nèi)變異系數(shù) CV%小于10%。
批間精密度：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在不同板塊內(nèi)精度評(píng)估。
批間變異系數(shù) CV%小于15%。
回收率
樣本回收率：80%-120%
靈敏度
經(jīng)樣本測(cè)試，本試劑盒的檢測(cè)靈敏度為1.56 ppb。
線性關(guān)系
校準(zhǔn)品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù) r 值，大于等于 0.999。
交叉反應(yīng)性
氯霉素：100%
實(shí)驗(yàn)步驟匯總
1.加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品和一抗，37℃反應(yīng)30分鐘，洗滌3次。
2.加酶標(biāo)二抗，37℃反應(yīng)30分鐘，洗滌4次。
3.加顯色液，37℃避光反應(yīng)15分鐘。
4.加終止液，在5分鐘內(nèi)讀數(shù)。
結(jié)果的計(jì)算
以濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線?；蛘呤褂媚軌蛏伤膮?shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計(jì)算機(jī)軟件來(lái)創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。
若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)并在計(jì)算樣本濃度時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
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