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酶標(biāo)記物工作濃度的選擇

酶標(biāo)記物包括酶標(biāo)記抗原、酶標(biāo)記抗體和酶標(biāo)記SPA等。酶標(biāo)記物質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到免疫酶技術(shù)的成功與否，因此被稱為關(guān)鍵的試劑。<o:p></o:p> 酶標(biāo)記物中常用的是酶標(biāo)記抗體，它是將酶與特異性抗體經(jīng)適當(dāng)方法連接而成。酶標(biāo)記抗體的質(zhì)量主要取決于純度好、活性強(qiáng)及親和力高的酶和抗體，其次要有良好的制備方法。<o:p></o:p> 目前，高質(zhì)量的酶(如辣根過氧化物酶，簡稱HRP)國內(nèi)已有商品供應(yīng)。高質(zhì)量的抗體則可通過提取純化而獲得。在制備方法上，宜選用產(chǎn)率高、不影響結(jié)合物的活性和不混雜干擾性物質(zhì)且操作簡便易行的方法。<o:p></o:p> 酶聯(lián)生物酶標(biāo)記物工作濃度的選擇<o:p></o:p> 在免疫酶技術(shù)中，首先要確定的變異因素就是酶標(biāo)記物的工作濃度。因?yàn)槊笜?biāo)記物濃度的很小變化，便可導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生很大的波動。另外，由于濃度過高，可使非特異性反應(yīng)增加，而濃度過低又可影響測定的敏感性。因此，正式試驗(yàn)前必須準(zhǔn)確滴定其工作濃度。<o:p></o:p> 酶標(biāo)記抗體的滴定方法是：將抗原(或抗體)物理吸附于固相載體上，然后將經(jīng)過一系列稀釋的酶標(biāo)抗體(或抗Ig抗體)與吸附在載體上的抗原(或抗體)起反應(yīng)，以酶與底物的顯色反應(yīng)程度來確定酶標(biāo)記抗體的效價，或稱工作濃度。<o:p></o:p> 其步驟為：<o:p></o:p> 先將抗原(或抗體)用0.05M PH9.6包被緩沖液稀釋為10μg／ml左右，于聚苯乙烯板孔內(nèi)加0.1ml，4℃過夜，次日以洗滌緩沖液洗滌3次。酶標(biāo)記抗體用1％BSA-PBS液依次稀釋成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600……(根據(jù)據(jù)抗體的滴度而定)，分別加入反應(yīng)孔中，每個稀釋度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小時后洗滌。<o:p></o:p> 然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分鐘。以2M H２SO４0.05ml終止反應(yīng)。<o:p></o:p> 結(jié)果判定主要以ELISA比色儀讀取各孔OD值。并以OD為縱座標(biāo)，結(jié)合物濃度為橫座標(biāo)，繪制滴定曲線。由曲線上查得OD值為1.0左右，且曲線斜率時的酶標(biāo)抗體稀釋度，即為該標(biāo)記物的工作濃度。<o:p></o:p> 有關(guān)試驗(yàn)的試劑及器材均見ELISA部分： 要說明的是，本法為ELISA直接法，所測的工作濃度與在實(shí)際應(yīng)用中的適濃度可相差幾個滴度。這就要求在建立ELISA實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中，因此基礎(chǔ)上還應(yīng)進(jìn)一步確定實(shí)際工作濃度(可采用方陣法)，以達(dá)到合適的實(shí)驗(yàn)條件。歡迎來電咨詢具體關(guān)于酶標(biāo)記物動態(tài)。<o:p></o:p>

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